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裸鼠成瘤实验

2016-01-19
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z6尊龙药理学服务为您提供裸鼠成瘤、裸鼠皮下成瘤等试验,详情可联系获得。邮箱:marketing@kangtya.com 电话:021 58591500。

裸鼠服务流程

    1、操作方案设计
2、方法开发
3、细胞制备
4、裸鼠成瘤

裸鼠皮下成瘤动物实验方法 

分组:SW620细胞组、SW620转染无关siRNA组、SW620转染目的基因(每组6只)。 
细胞准备及注射裸鼠方法: 到动物室准备实验。 

取出未作处理的小鼠和处理后小鼠用鼠笼,顺序摆放在超净台中。选体形较大的小鼠称重,以3μl/g剂量,腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠。约5分钟,小鼠开始进入安静状态,将其仰卧固定。切忌麻醉剂过量使用。 

(1)铺白布于鼠板上,仰卧位固定小鼠四爪,碘伏棉球消毒腹侧面上至颈部、下至腹股沟、后至腋后线。消毒两次。铺手术巾于小鼠上,在其左侧剪口(4*4cm),暴露其左侧腹部, 用碘伏消毒一次。在左侧肋弓下缘1cm处向下剪开2cm皮肤,暴露腹壁肌肉,镊子牵拉腹壁肌肉,避开腹腔内脾脏,剪开腹壁肌肉,暴露内脏。用棉签蘸PBS,拨出脾脏下极,切忌牵拉,以免损伤脾脏和胰腺。 
(2)找到脾脏同时,用25微升Matrigel混合于细胞管中,打悬细胞沉淀,使细胞分散均匀成单细胞悬液。用BD针吸净EP管中的单细胞悬液,稍退针芯,打出气泡,在脾脏下极内侧(凹面)进针向脾门方向约2mm开始注射细胞,注射完毕停留约30秒钟,缓慢退出针,以防细胞渗出。同时用蘸PBS的棉球压迫周围出血点止血。 
(3)用注射器吸取庆大霉素注射液(用生理盐水250:1稀释)约400微升,注入腹腔,棉球蘸干皮缘渗出的抗生素。开始缝合腹壁肌肉(连续缝合4针)。再次用注射器吸取庆大霉素注射液约400微升冲洗缝合口,棉球蘸干。缝合皮肤(间断缝合4针)。碘伏棉球消毒缝合口。撤除固定,使小鼠处于自然体位,放于鼠笼中。 
(4)所有细胞注射完毕,剪耳标记,记录剪耳标记及分组情况。 
Day5-7:注意小鼠的状态,及时发现小鼠是否有因手术刺激、胰腺损伤、感染等死亡的情况。 
Day42:颈椎离断,处死小鼠,解剖尸体,观察脾脏肿瘤生长状况,肝脏、肺脏及其他器官是否有转移瘤形成。所有可疑组织均做好标记,拍照,若有表面结节,计数后,冻于液氮中。视结果情况用10%甲醛溶液固定过夜后做病理。 

裸鼠皮下成瘤实验技巧

1、细胞状态是成瘤实验的关键,所以细胞生长状态一定要好,取处于对数生长期的细胞,细胞达80-90%左右密度为宜;收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。
2、胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍,目的为去除细胞中的血清。
3、用PBS或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度,一般皮下瘤接种的细胞量为1-5×10^6个细胞/支,接种体积为0.1ml,因此细胞悬液的浓度为1-5×10^7个细胞/ml。
4、细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下,一般尽量在半小时内完成,途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢。
5、选择的裸鼠一般在5-8周龄,体重18-20g左右,种植部位选择血供丰富区域,如腋窝中后部、腹股沟中上部。
6、接种前用枪将细胞悬液充分的吹散,防止细胞成团而降低细胞成活率。
7、接种时,针头在皮下进针深一点,约1cm深,减少注射后细胞悬液从针眼溢出。
8、如何抓牢裸鼠?左手拇指和食指捏紧裸鼠颈背部皮肤,小拇指夹住裸鼠尾巴。

裸鼠成瘤实验

9、接种后一周左右可以见到皮下开始出现肿块。
10、根据肿瘤细胞的特性和接种细胞的量,一般皮下成瘤的周期为1-2个月。肿瘤不宜生长过大,一般不要超过1000mm3 ,肿瘤负荷过大常常会以违背动物伦理而被杂志社刁难(因为这个问题悲惨地被plos one拒过稿)。
11、肿瘤大小测量一般为1周两次,游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位。V=1/2*a*b2 (a为长轴,b为短轴)。
12、皮下瘤取下后一部分冻液氮用作以后提蛋白和RNA,一部分福尔马林固定用做免疫组化、免疫荧光等。


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